QqOrbitrap (QExactive, Thermo)


Le Q Exactive est un spectromètre de masse hybride combinant les performances d’un quadrupole pour la sélection de précurseur avec une grande précision et un Orbitrap pour une détection à haute résolution et grande précision (high resolution / accurate mass - HR/AM).

Cette configuration permet d’accroitre la vitesse de balayage et offre une possibilité nouvelle de multiplexage, la rendant compatible avec la chromatographie ultra rapide.

Le Q Exactive est adapté aussi bien aux analyses de routine pour des identifications bottom-up de protéines qu’aux analyses semi-quantitatives (marquages isotopiques) et ciblées de type PRM (parallel reaction monitoring) grâce à la haute résolution apportée par l’orbitrap.

Domaines d’applications

  • Identification des protéines provenant d’un mélange simple (injection directe), ou d’un milieu complexe après séparation par LC 1D ou 2D.
  • Recherche de masses exactes de modifications
  • Quantification de peptides après marquage ITRAQ,ICAT, TMT ou SILAC

Principe de la mesure

La combinaison QqOrbitrap combine deux avantages : le premier quadripôle permet de sélectionner très rapidement les ions d’intérêt car les temps d’application de tension sont très faibles et il n’y a pas de balayage et le second quadripôle en mode HCD permet de fragmenter les peptides sur une échelle de temps similaire. De plus la séparation dans l’espace et la possibilité de travailler à haute résolution en mode MS et MS/MS ouvre le champ aux analyses en multiplexe.

Les ions formés dans la source électrospray (seule disponible commercialement sur ce type d’appareil) vont être accélérés et entrer dans l’analyseur Orbitrap pour être séparés selon le rapport masse/charge. L’orbitrap se compose d’une électrode creuse, à l’intérieur de laquelle est placée coaxialement une électrode en forme de fuseau. La forme particulière de ces deux électrodes permet l’imposition d’un champ électrostatique quadripolaire suivant l’axe z des électrodes. Les ions sont injectés tangentiellement à l’électrode centrale et piégés autour d’elle par la force électrostatique qui compense les forces centrifuges. Le mouvement des ions se décompose alors ainsi : un mouvement circulaire autour de l’électrode centrale dans le plan (xy) et un mouvement oscillatoire de va-et-vient selon l’axe z. En particulier, les ions d’un m/z donné seront sur la même trajectoire circulaire qui oscille axialement avec une fréquence f, indépendante de la vitesse ou de l’énergie des ions. De la même façon que pour le FT-ICR, le courant induit par ces oscillations permet par une transformée de Fourier d’accéder aux m/z. Un modification du traitement du signal a été implémentée. Les transients détectés dans un Orbitrap sont traités par transformée de Fourier optimisée (eFT™) pour convertir le signal temporel en fréquence puis en rapport m/z. Ces calculs ont été détaillés par [ ]. Le calcul de la transformée de Fourier utilise des nombres complexes, qui peuvent être assimilés comme l’amplitude et la phase du signal, ou encore par une partie réelle et une partie imaginaire en mathématiques. Comme la phase initiale du paquet d’ions dépend des paramètres initiaux au moment de l’injection de façon relativement complexe, les spectres FT sont interprétés en général dans le mode dit "amplitude", ce qui revient à ne pas considérer les informations de phase. Cependant en Orbitrap la conception du mécanisme d’excitation par injection fournit une phase initiale indépendante de m/z en première approximation. Cette synchronisation permet de convertir les spectres de telle sorte que la composante réelle des données peut être exploitée, ce qui permet d’obtenir des pics plus fins. En pratique ce mode eFT, en utilisant les composantes réelle et imaginaires du signal permet d’améliorer la précision de masse et les profils de pic. La synchronisation est meilleure si la détection démarre dès la fin de l’injection. Ce principe a été appliqué en abaissant le délai entre l’injection et la détection d’environ 10 ms à une fraction de ms, ce qui revient à augmenter la résolution d’un facteur légèrement inférieur à 2 pour le même enregistrement de transient (sauf dans le cas des protéines dont le signal se dégrade rapidement d’environ un facteur 1,4 par collision avec les molécules de gaz résiduel) Le temps de traitement des données reste inférieur au temps d’acquisition et d’injection. Cependant pour être efficace l’eFT demande une très bonne synchronisation électronique et reste sensible au délai de transfert d’information. La précision de mesure reste comparable aux résultats obtenus par FT classique.

Multiplexage

La sélection des précurseurs se faisant "dans l’espace" (au niveau du quadripôle) est extrêmement rapide. Ceci permet une association complexe d’opérations MS et MS/MS suivie d’une analyse en haute résolution au niveau de l’Orbitrap (voir [193]).

En Selected Ion Monitoring (SIM) une gamme de masse étroite est accumulée pour augmenter le rapport signal sur bruit d’un ion d’intérêt. Les analyses SIM sont possibles dans les configurations LTQ Orbitrap mais ne sont pas souvent utilisées. En effet (1) l’isolation en mode SIM dans la trappe linéaire est relativement lente, (2) le nombre d’ions qui peuvent être isolés est limité par des effets de charge spatiale, (3) l’analyse dans l’Orbitrap d’un unique scan SIM est longue. Le Q-Exactive ne souffre pas des mêmes limitations. En mode SIM la C-trap est utilisée comme zone de stockage des ions et est remplie aves le nombre d’ions désiré. Dans des analyses de multiplexage en mode SIM, jusqu’à 10 ions de valeurs m/z différents peuvent être stockés dans la C-trap avant d’être simultanément injectés et analysés dans l’Orbitrap (voir Figure 1). Comme les temps de remplissage sont plus courts que les temps de détection des transients, l’Orbitrap est utilisé de façon beaucoup plus efficace en multiplexe.

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