Projet doctoral Septembre 2021

Doctorat PSL (ED388, spécialité Chimie analytique, protéomique)

Etude du redoxome et des modifications post-traductionnelles associées : application au stress oxydatif du reticulum endoplasmique

• Publié le 05 mars 2021
https://www.smbp.espci.fr/

Description du projet

Lors de leur translocation dans le réticulum endoplasmique (ER), les polypeptides sont glycosylés et repliés sous leur forme native. Pour beaucoup d’entre eux, le repliement est stabilisé par des liaisons disulfure, dans un processus nommé repliement oxydatif des protéines. La formation de ces disulfides est catalysée par l’ER oxidase Ero1, une enzyme FAD qui réduit O2 en H2O2 et qui en retour s’oxyde en disulfide catalytique (1). Le mauvais repliement des protéines provoque un stress dans l’ER, ce qui déclenche une cascade d’évènements appelée Unfolded Protein Response (UPR) visant à restaurer l’homéostasie des cellules. En effet, si ce stress n’est pas résolu, il peut entrainer la mort cellulaire. Les éléments influençant le devenir des cellules pendant le stress de l’ER ont fait l’objet d’investigations intenses, car elles ont des implications pertinentes pour de nombreuses pathologies humaines, en particulier dans le cadre du cancer et du diabète (2).

Outre la glycosylation, l’oxydation joue un rôle central dans les processus cellulaires. Son propre rôle physiologique et son influence dans les processus liés au cancer ou au vieillissement sont peu compris. Si le stress oxydatif peut perturber les fonctions biologiques, les réactions d’oxydation-réduction (redox) dans une cellule sont souvent très finement régulées. Un nombre croissant de commentaires indiquent que l’oxydation des Cys devrait être considérée comme une modification post traductionnelle impliquée dans la régulation des protéines. Les résidus de méthionine sont également très réactifs et ont été décrits comme impliqués dans les effets croisés de l’oxydation et la glycosylation des protéines. Le statut de la protéine redox a souvent un impact sur son activité catalytique, sa conformation ou les interactions avec les métaux.

Notre groupe est impliqué dans un projet de recherche (ANR Erred2) visant à étudier l’impact du métabolisme redox sur la physiopathologie de l’ER. Nous avons déjà développé un pipeline analytique pour quantifier les événements redox de cystéine à l’échelle du protéome (5). Ces approches devraient fournir l’instantané le plus proche possible de l’état redox. Toutefois, l’analyse des protéines impliquées dans la signalisation de ce stress redox est encore limitée par leurs faibles abondances. Il est ainsi important d’établir l’identité et les fonctions de deux des composants encore mal caractérisés du métabolisme de l’ER, afin de d’identifier (i) les voies fournissant des équivalents réducteurs des thiols, et (ii) les sources du H2O2 produits pendant le stress, et leur lien fonctionnel avec la voie d’oxydation des thiols et avec l’UPR. Il faut donc concevoir des outils spécifiques pour surveiller les indicateurs du stress de l’ER. Aujourd’hui, de nombreux outils de bio-analyse sont utilisés pour surveiller le stress de l’ER (3). Ceux-ci sont principalement basés sur le suivi du titre de certaines protéines clés par immunodétection et par analyse des transcripts associés. En outre, la cascade de signalisation impliquant une phosphorylation est également surveillée par des anticorps spécifiques.

La principale limitation de ces techniques est qu’il s’agit d’un ensemble hétérogène d’outils de détection indirecte qui ont besoin d’anticorps et d’amorces. Une première tentative de surveillance des niveaux d’indicateurs de protéines de stress aux ER de faible abondance a été récemment réalisée (4), montrant les améliorations potentielles que la spectrométrie de masse peut apporter dans ce domaine. Toutefois, le profilage des modifications post-translationnelles impliquées dans l’UPR fait toujours défaut.

L’objectif de ce projet de doctorat est de mettre en place une méthode ciblée de spectrométrie de masse visant à surveiller en une seule analyse de nombreux indicateurs de stress de l’ER comprenant le suivi d’abondance des protéines et des modifications post-translationnelles. Ceci sera effectué en combinant à diverses étapes la nanochromatographie capillaire, la chimie des protéines et les méthodes de spectrométrie de masse à haute résolution.

Plusieurs aspects technologiques du projet :

• Travailler sur des systèmes microfluidiques confinés pour surmonter les phénomènes redox induits par la présence d’espèces oxydatives environnantes.
• Développer un système en nano chromatographie (nanoLC) dédiée optimal en fabriquant ses propres colonnes (75µm ou moins de diamètre interne) en éliminant les volumes morts.
• Développer et optimiser un couplage en nanoLC tandem mass spectrometry (MS/MS) avec ou sans séparation par mobilité ionique afin de couvrir au mieux l’échantillon complexe et de détecter les espèces mineures avec leur hétérogénéité.
• Caractériser les modes d’analyses dédiés pour l’étude des oxydations, des glycosylations et des phosphorylations des protéines d’intérêt.
Le groupe soutiendra fortement ce projet central qui bénéficiera des infrastructures uniques pour la protéomique (installation ESPCI) et la microfluidique (installation IPGG).

Mots-clés

Spectrométrie de masse, redoxomics, glycoproteomics

References

1.Sevier C.S. & Kaiser C.A. Ero1 and redox homeostasis in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta 1783, 549-56 (2008).
2.Cao S.S. & Kaufman R.J. Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease. Antioxid Redox Signal 21, 396-413 (2014).
3. Sicari S. , Delaunay-Moisan A. , Combettes L., Chevet E., Igbaria A. A guide to assessing endoplasmic reticulum homeostasis and stress in mammalian systems. FEBS J. 2020 Jan ;287(1):27-42.
4.Nguyen C.D.L. , Malchow S. , Reich S. , Steltgens S. , Shuvaev K.V. , Loroch S., Lorenz C., Sickmann A., Knobbe-Thomsen C.B., Tews B., Medenbach J., Ahrends R. A sensitive and simple targeted proteomics approach to quantify transcription factor and membrane proteins of the unfolded protein response pathway in glioblastoma cells. Sci Rep. 2019 Jun 20 ;9(1):8836.
5. Barraud N., Létoffe S., Beloin C., Vinh J., Chiappetta G., Ghigo J.M. Lifestyle-specific S-nitrosylation of protein cysteine thiols regulates Escherichia coli biofilm formation and resistance to oxidative stress. doi : https://doi.org/10.1101/2020.09.29.318139

Unité de recherche

Spectrométrie de masse biologique et protéomique, ESPCI Paris, Université PSL, 10 rue Vauquelin 75005 Paris

Description de l’unité de recherche/sous-unité

Notre groupe de recherche a été créé en 2009 et fournit des solutions protéomiques. Il effectue des développements technologiques constants. Nous avons été particulièrement impliqués dans des stratégies multidimensionnelles sensibles pour la quantification des protéines, dans l’analyse différentielle, y compris SILAC, et dans la caractérisation des modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse. En particulier, nous avons récemment combiné la chimie analytique, la biochimie et la chimie des protéines pour étudier l’oxydation et la glycosylation des protéines. Nous avons récemment élaboré une stratégie spécifique pour identifier les protéines qui seront mises en œuvre dans le cadre de ce projet. Nous hébergeons une plate-forme technologique protéomique entièrement équipée. Les dispositifs microfluidiques seront produits sur la plate-forme de microfabrication du Labex IPGG dont nous sommes partenaires. Nous souhaitons développer un poste de fabrication de supports de séparation en nanoLC maison.

L’encadrement

Directeur : Joëlle Vinh (Joëlle.Vinh (at)espci.fr )
Co-directeur : Giovanni Chiappetta (Giovanni.Chiappetta (at)espci.fr )

Aspects 3i de la proposition

Intersectorialité Le projet comprendra une stratégie multidisciplinaire utilisant la spectrométrie de masse, les microfluidiques, la microfabrication, la protéomique et la bioinformatique. Il est de la plus haute importance pour l’application industrielle car il y a un besoin important d’étude des modifications post-translationnelles, soit pour le contrôle de la qualité de la production et le stockage, ou pour le diagnostic et la prise en charge clinique.
Interdisciplinarité Le projet est un projet interdisciplinaire à l’interface entre la chimie des protéines, la chimie physique, la microfluidique et la biologie. Il faut une forte implication du candidat qui devra être formé sur diverses disciplines, de la nanochromatographie à la microfabrication et à la conception d’interfaces, ainsi qu’à la biologie et à la protéomique.
Mobilité internationale En cas de succès, la stratégie sera appliquée à des projets en collaboration avec des groupes italiens sur le cancer de la thyroïde. Plus généralement, il n’y a aucune stratégie disponible pour étudier les modifications de redox et glycosylation de protéine simultanément, et une fois validé le protocole sera transféré sur la plateforme de protéomique de l’ESPCI (plateforme nationale, avec plus de 100 utilisateurs/an)
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Le candidat

Ce projet doctoral est à l’interface de la chimie analytique et de la biologie.
Master M2 avec une dominante en chimie analytique. Une connaissance (théorique) de la spectrométrie de masse et des techniques de séparation miniaturisées est attendue. Il doit avoir validé un master M2 complet, ou un diplôme d’ingénieur.
Le candidat doit avoir une bonne formation en biochimie et en chimie analytique. Les expériences antérieures dans le domaine des techniques séparatives, de la spectrométrie de masse ou de la chimie des protéines sont bienvenues. Enfin l’analyse des résultats fait appel à des outils de traitement de données en bio-informatique qui peut nécessiter de développer des outils spécifiques

Appel à candidatures : du 1er mars au 31 mai 2021
Entretiens : au fil de l’eau, par visio ou en présentiel
Les critères d’admissibilité suivants doivent être remplis afin que la demande puisse être évaluée.
Les candidats doivent satisfaire aux critères d’admissibilité suivants :

  • Merci de candidater en envoyant par mail un dossier comprenant a minima CV détaillé, lettre de motivation pour le projet, copie et relevé de notes des deux derniers diplômes, lettres de recommandation ou attestation pour les expériences préalables éventuelles.
  • Au moment de la date limite d’appel à candidatures, les candidats doivent être en possession ou finaliser leur master ou leur diplôme équivalent/de troisième cycle.
  • Au moment du recrutement, les candidats doivent être en possession de leur master ou d’un diplôme équivalent/troisième cycle qui aurait officiellement le droit d’entreprendre un doctorat.
  • Les candidats en possession de leur master au moment de l’appel à candidatures doivent être dans les quatre premières années (expérience de recherche équivalent temps plein) de leur carrière de recherche (pauses carrière exclues). Les pauses de carrière désignent les périodes où le candidat n’était pas actif dans la recherche, quel que soit son statut d’emploi (congé de maladie, congé de maternité, etc.). Les courts séjours tels que les vacances et/ou le service national obligatoire ne sont pas pris en compte.
  • Les candidats doivent être disponibles pour commencer le programme dans les délais prévus (au plus tard en septembre 2021)
  • Les citoyens de toute nationalité peuvent candidater.

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